En què consisteix una PCR?

La reacció en cadena de la polimerasa (la famosa PCR) és una tècnica que s’utilitza per a «amplificar» petites quantitats d’ADN. La sigla PCR ve del nom en anglès de la tècnica: Polymerase Chain Reaction. El material genètic en petita quantitat resulta invisible per als mètodes d’anàlisis, fins i tot els més moderns, per la qual cosa és necessari realitzar còpies, moltes, moltes còpies (d’aquí el verb «amplificar») per a poder estudiar-ho o detectar-ho. T’expliquem una mica més detalladament aquesta tècnica, tan trencadora que va rebre el premi Nobel de química de l’any 1993.

Què és la reacció en cadena de la polimerasa?

És la repetició successiva d’una reacció química en la qual s’aprofita un enzim anomenat polimerasa per a generar més ADN a partir d’una mostra de material genètic original. Per a entendre-la bé hem de conèixer uns detalls de l’ADN prèviament, així que comencem pel principi.

L’ADN és una macromolècula, és a dir, una molècula gegant, composta d’unitats més petites anomenades «nucleòtids». Els nucleòtids s’uneixen químicament per a formar una cadena, i dues cadenes complementàries són capaces d’unir-se i torçar-se sobre si mateixes per a formar una doble hèlix. Entre altres propietats de l’ADN, comptem amb:

• La doble hèlix s’obre en escalfar-se, i s’obtenen dues cadenes simples de nucleòtids.
• Cadascuna d’aquestes cadenes pot servir de motlle per a la cadena companya que forma la doble hèlix, perquè són cadenes perfectament complementàries. Aquesta propietat permet que l’ADN sigui «autocopiant» amb els enzims de síntesis adequades, sent una de la més important l’enzim anomenat ADN polimerasa.
• L’ADN polimerasa pot copiar una cadena utilitzant nucleòtids individuals solts com si fos un paleta que fa una paret a partir de maons, però necessita almenys tenir un trosset de cadena complementària disponible per a començar a sintetitzar una nova cadena. A aquest trosset l’anomenem primer.

La reacció en cadena de la polimerasa aprofita aquestes propietats per a obtenir una bona quantitat de material genètic a partir de poques (o fins i tot d’una) dobles hèlixs.

Com funciona la reacció en cadena de la polimerasa?

Suposem que partim d’una sola cadena doble d’ADN trobada en una mostra biològica (sang, pell, secrecions nasals, etc.). A aquesta mostra podem afegir-li polimerasa, primers i nucleòtids, i dur a terme els següents passos amb un equip automatitzat:

• Escalfament de la mostra a una temperatura tal que s’obri la doble hèlix, però no es destrueixi (90-95 °C).
• Refredament lleuger del medi de reacció, perquè s’uneixin les cadenes simples amb els primers disponibles en el medi.
• Síntesi d’una nova cadena complementària a les anteriors. Això es realitza a través de polimerases capaces de tolerar l’escalfament i de treballar a 60-75 °C, com la polimerasa provinent dels microorganismes Thermus aquaticus (TaqDNA polimerasa, la primera a usar-se) o Pyrococcus furiosus (PfuDNA polimerasa, una miqueta millor copiant que la primera).

En finalitzar aquests passos, en comptes d’una doble cadena d’ADN tenim dues cadenes d’ADN, perquè cada cadena es va usar com a motlle per a una nova doble hèlix. Si afegim a aquest cicle altre igual, en comptes de quatre cadenes tindrem vuit. I si encadenem molts cicles («reacció en cadena») obtindrem una quantitat important d’ADN amb el qual podrem diagnosticar una infecció, fer una prova de paternitat, trobar al culpable d’un assassinat, etc. I si controlem acuradament les condicions de reacció, podem tenir una idea de quant material genètic teníem en començar: en el nostre exemple, si necessitem partim de 50 dobles hèlixs d’ADN necessitarem un cicle per a arribar a 100 cadenes, però si partim d’una sola, necessitarem diversos cicles (una hèlix resulta en dues, dues resulten en quatre, quatre resulten en vuit….i així successivament).

Què és la RT-PCR?

La RT-PCR és una modificació de la tècnica de la PCR necessària per a treballar amb material genètic de tipus ARN, com el que es troba en el virus Sars-CoV-2 o el VIH. La polimerasa només pot treballar amb ADN, per la qual cosa necessitem un enzim que sintetitzi una cadena d’ADN complementària a la cadena d’ARN original; aquesta funció la compleix l’enzim anomenat transcriptasa reversa. El primer pas de la RT-PCR és la síntesi de l’ADN complementari a l’ARN original i la destrucció de l’ARN, per a després fer els mateixos cicles de la PCR explicats a dalt.

El nom RT-PCR ve de l’anglès reverse transcription – polymerase chain reaction.

Què és la rRT-PCR?

La r minúscula és el símbol de «real time», és a dir, «en temps real». És una modificació de la RT-PCR que permet fer un seguiment detallat dels cicles de reacció i és molt útil per a quantificar el material genètic de la mostra.

Quines limitacions presenta la PCR?

La PCR i les tècniques relacionades són molt fiables, però presenten alguns inconvenients:

• Requereixen temps. Es requereixen diverses hores per a obtenir el resultat d’un pacient, limitant la capacitat d’un laboratori per a lliurar resultats.
• Alta sensibilitat a la contaminació. Els laboratoris solen treballar en àrees separades per a la pre-amplificació i per a la post-amplificació, perquè la contaminació amb poquetes cadenes d’ADN pot donar un fals positiu. La PCR sol fer-se amb un control negatiu (reacció sense material genètic present) que, si dóna positiu, delata una possible contaminació del sistema de reacció.
• Són costoses. L’aparell que fa aquestes proves no és barat, els materials per a dur a terme la prova tampoc són econòmics i es requereix personal qualificat per a operar-ho i interpretar el resultat correctament.

És per això que, en moments crítics com pot ser la pandèmia de covid-19, s’han buscat opcions més ràpides i econòmiques a la PCR com els tests d’antígens, que estan llestos en 15 minuts i no requereixen tant d’equip o instal·lacions.